1.2 埃：這是該圖像的分辨率。也就是說，它能顯示的細(xì)節(jié)精度達(dá) 0.12 納米，逼近最小的原子，即氫原子的直徑！圖中出現(xiàn)了去鐵鐵蛋白大分子中的碳、氧、氮等原子。在原子級分辨率冷凍電鏡出現(xiàn)之前，這些細(xì)節(jié)只能通過 X 射線晶體學(xué)方法重建。

　　來源： 新發(fā)現(xiàn)雜志

　　研究人員頭一回在一個分子內(nèi)部以三維圖像的形式直接捕獲原子的模糊輪廓！實現(xiàn)了上述創(chuàng)舉的冷凍電鏡還有望揭開更多生物進(jìn)程的奧秘。

　　這張照片得到了業(yè)內(nèi)人士的一致贊賞。

　　我們可以看到，這是一個存在大量分支的球狀物，上面裝飾著去鐵鐵蛋白（血液中的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的大分子，甚至可以從中解析最小的原子——電子顯微鏡首次達(dá)到1.2埃（0.12納米）的原子級分辨率！

　　“這是蛋白質(zhì)顯微結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域的一個巨大飛躍。”巴黎綜合理工學(xué)院生物化學(xué)家、電子顯微鏡專家皮埃爾-達(dá)米安·庫勒（Pierre-Damien Coureux）歡呼道。德國馬普生物物理化學(xué)研究所的霍爾格·施塔克（Holger Stark）是實現(xiàn)該突破的主角之一，他認(rèn)為“提高分辨率的終極障礙已被克服”。

　　其實，人們早已“見過”原子了：1950年代起，X射線晶體學(xué)就實現(xiàn)了原子的可視化。然而，這只是一種間接方法：通過對X射線照射樣品創(chuàng)建的衍射圖像進(jìn)行處理和解釋，研究人員可重建樣品的分子結(jié)構(gòu)。

　　此外，該技術(shù)只能用于可形成晶體的化學(xué)物質(zhì)的研究，也就是那些原子排列規(guī)則的固體——盡管大多數(shù)礦物（鹽、水……）都滿足此要求，但許多活性分子（例如蛋白質(zhì)）卻是不規(guī)則的。

　　最后，X射線晶體學(xué)的最大不足就是缺乏強(qiáng)制冷凍蛋白質(zhì)的技術(shù)。

　　重現(xiàn)分子運(yùn)動

　　然而，蛋白質(zhì)分子的主要特征是“極易彎曲，始終處于運(yùn)動狀態(tài)”，雅克·杜博歇（Jacques Dubochet）評論道。

　　因發(fā)展了冷凍電鏡技術(shù)，這位瑞士洛桑大學(xué)榮譽(yù)教授與美國哥倫比亞大學(xué)的約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）、英國劍橋大學(xué)的理查德·亨德森（Richard Henderson）榮膺2017年諾貝爾化學(xué)獎。

　　阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）

　　40年前，杜博歇在觀察蛋白質(zhì)的自然排列時發(fā)明了冷凍電鏡。他找到了一種將蛋白質(zhì)封入“玻璃態(tài)水”（低密度無定形冰）中而凍結(jié)其運(yùn)動的方法：人們由此觀察到了蛋白質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)發(fā)生相互作用時的千姿百態(tài)。“如今，冷凍電鏡的分辨率真的已經(jīng)達(dá)到原子級。”這位已退休的研究人員自豪地總結(jié)道。

　　懸于低密度無定形冰中的 GroEL 蛋白。在水中純化蛋白質(zhì)，然后將一片穿孔的膜浸入該蛋白質(zhì)溶液，從而使蛋白質(zhì)在其孔隙中伸展并充分勾勒出自身結(jié)構(gòu)。最后，將所有物質(zhì)浸入 -182℃的液態(tài)乙烷中。快速的冷卻過程使水以玻璃態(tài)凝結(jié)，如同一塊保護(hù)性的脈石般包裹著蛋白質(zhì)。

　　低溫顯微鏡之所以必然是電子顯微鏡，是因為只有電子才能顯示出原子的輪廓，而光學(xué)顯微鏡中的可見光會繞過原子導(dǎo)致無法顯像。傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡使用的可見光只能分辨間距不短于自身半個波長的兩個相鄰點，因此充其量只能區(qū)分200納米的細(xì)節(jié)。

　　然而，原子的大小在0.1到1埃之間，是傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨率的萬分之一！波長短得多的電子束的尺寸能達(dá)到0.02埃。而電子顯微鏡的缺點在于，電子束帶有負(fù)電荷，會與樣品發(fā)生相互作用并切斷有機(jī)分子鍵，從而降低成像效果！

　　這是電子顯微鏡的經(jīng)典技術(shù)：向樣品發(fā)射電子束，電子束透過樣品照射到閃爍體探測器上并發(fā)出光子，繼而被 CCD 相機(jī)檢測到。然而2013 年，能夠直接檢測電子的新型照相機(jī)徹底改變了這一過程。

　　另外，電子也非常敏感，任何干擾都會影響其運(yùn)動。因此，只有當(dāng)研究對象是純凈的化學(xué)物質(zhì)且處于真空環(huán)境中，電子顯微鏡才能得到準(zhǔn)確的圖像。然而在真空環(huán)境中，蛋白質(zhì)會被破壞。

　　因此迄今為止，蛋白質(zhì)的透射電子顯微鏡圖像一直都類似于半融化的蠟雕。長期以來，上述研究一直被批評者嘲諷為“斑點學(xué)”！

　　所幸近年來，難題已被一一解決：杜博歇將蛋白質(zhì)固定在玻璃態(tài)水中的方法進(jìn)行改進(jìn)，可以防止蛋白質(zhì)被電子和真空破壞；極細(xì)電子束的開發(fā)進(jìn)一步減少了蛋白質(zhì)的損壞，超精確相機(jī)實現(xiàn)了單電子探測，若干新算法還校正了光學(xué)像差和其他畸變。

　　更重要的是，如今超級計算機(jī)的強(qiáng)大性能可以對收集于單個樣本的成千上萬張圖像進(jìn)行合成，從而展現(xiàn)出無與倫比的精確度。

　　要看清原子，僅靠一張照片是不夠的：相機(jī)從數(shù)百個角度記錄下數(shù)千張圖像來獲取三維結(jié)構(gòu)，并且記錄了樣品中成千上萬的分子。將所有數(shù)據(jù)合成單幅圖像需要數(shù)周的計算。最重要的是，還需要一種基于化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵排列方向概率的強(qiáng)大算法，來提高圖像精度。如今，這些程序甚至能夠區(qū)分樣品分子采用的各種構(gòu)象

　　水到渠成。2020年5月，馬普研究所霍爾格·施塔克團(tuán)隊，以及劍橋大學(xué)MRC分子生物學(xué)實驗室的舍爾斯·謝雷斯（Sjors Scheres）和拉杜·阿里切斯庫（Radu Aricescu）團(tuán)隊于同一天宣布實現(xiàn)了原子級分辨率。

　　這是人類首次分辨出分子中的原子！無巧不成書，這兩個團(tuán)隊研究的是同一個大分子，即去鐵鐵蛋白。對致力于將冷凍電鏡分辨率推向極限的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家來說，這種將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到血紅蛋白的蛋白質(zhì)確實是一種理想的試驗品。

　　“這是一個非常穩(wěn)定且對稱的大分子。”舍爾斯·謝雷斯解釋說，“我們甚至通過冷凍電鏡看到了單個氫原子。”

　　“幾年來，我們對化學(xué)物質(zhì)的感知已經(jīng)從顯示化學(xué)物質(zhì)的大概形態(tài)，發(fā)展到了原子級別的觀察。”皮埃爾-達(dá)米安·庫勒描述道，“這改變了生物學(xué)的一切。”

　　事實上，生命的活動建立于原子間的精妙相互作用：異性電荷相吸，同性電荷相斥，蛋白質(zhì)像多極化的磁體一樣與受體結(jié)合。由此實現(xiàn)了諸如神經(jīng)元之間的信息傳遞，病毒入侵細(xì)胞，藥物阻斷有害效應(yīng)……

　　核糖體的完整翻譯過程

　　“今后我們將能看到在活體環(huán)境中的蛋白質(zhì)，觀察它們在與受體相互作用時是如何改變構(gòu)象的。”瑞士巴塞爾大學(xué)的菲利普·蘭格萊（Philippe Ringler）興奮地表示，他正目睹冷凍電鏡勢不可擋的浪潮，“許多晶體學(xué)家在接受冷凍電鏡的操作培訓(xùn)，而各所大學(xué)也開始逐步配備強(qiáng)大的成像設(shè)備。”

　　微管是如何在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)元素的？核糖體（上圖）是如何翻譯基因組的？線粒體是如何吞吐維持其機(jī)能所需的物質(zhì)的？今后，生物學(xué)家將借助電鏡看到運(yùn)轉(zhuǎn)中的細(xì)胞工廠。

　　得益于該技術(shù)，2020年7月，美國馬薩諸塞大學(xué)的一個團(tuán)隊從基因組的編碼入手，準(zhǔn)確地描繪出細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)是如何“編織”在一起的。

　　在冷凍電鏡下放置了一些核糖體后，研究人員觀察到，這些由蛋白質(zhì)和RNA組成的結(jié)構(gòu)通過折疊成精確的構(gòu)型，形成若干空腔并在腔內(nèi)插入了不同的部件：確保準(zhǔn)確翻譯的基因組片段，以及將要組裝的蛋白質(zhì)載體。隨著翻譯的進(jìn)行，這些部件從一個腔傳遞到另一個腔。在前所未有的精度下，整個過程宛如一場由眾多分子共同扭動的芭蕾舞！

　　除此以外，還有更多利用冷凍電鏡原子級分辨率的研究正在開展中。例如，通過識別出最適合嵌入受體的分子來加速藥物或疫苗的開發(fā)。在鑒別出COVID-19后的頭一個月，數(shù)十個團(tuán)隊就制取了若干該病毒的冷凍電鏡圖像來觀察其表面的分子，從而了解其附著在人類細(xì)胞中的具體位置。

　　隨后，這些圖像可以幫助研究人員更快地識別出能夠阻止病毒附著、預(yù)防感染的候選藥物。還有研究試圖通過觀察神經(jīng)遞質(zhì)附著在膜受體上的過程，將神經(jīng)信號在神經(jīng)元間傳遞的過程可視化。

　　這樣一來就可以制造出針對癲癇、疼痛或戒斷發(fā)作的靶向藥物。還有的研究希望能夠解釋在阿爾茨海默病患者的大腦中積聚的斑塊（參見下方圖示）……

　　阿爾茨海默病是由大腦中的淀粉樣沉積物所引起的，這些淀粉樣斑塊由蛋白質(zhì)塊組成。解密其與腦細(xì)胞的相互作用以及它們在腦中的蔓延方式或許會開發(fā)新的治療途徑。

　　這只是冷凍電鏡原子革命的開始，卻也可以認(rèn)為是一個完美的結(jié)束，因為該技術(shù)的分辨率幾乎無法再提高了。“我認(rèn)為冷凍電鏡的分辨率能達(dá)到1.1甚至1埃。”舍爾斯·謝雷斯預(yù)測道，“不過為此糾正像差需要處理海量的數(shù)據(jù)。”

　　目前，研究人員的目標(biāo)是將原子級分辨率擴(kuò)展到比去鐵鐵蛋白更復(fù)雜的分子。2020年初，冷凍電鏡三維分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫已建檔10000組數(shù)據(jù)。在理查德·亨德森看來，到2024年，冷凍電鏡技術(shù)產(chǎn)生的研究數(shù)據(jù)或許會比X射線晶體學(xué)更多。

　　化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的一個全新局面正徐徐打開。

　　撰文 Anne Debroise

　　編譯 周玉府