來源：Nature Portfolio　　

　　依賴細菌運動、基因組學和機器學習的診斷方法可能有助于解決全球危機。

　　2007年，Maha Farhat在南非德班的一家醫院照顧病人。許多人感染了HIV（艾滋病病毒）。但是，令當時的住院醫師Farhat和她的病人焦慮不安的感染并不是由病毒引起的，而是一種細菌：結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，肺結核的病原體）。特別令她擔心的，是對普通抗生素有耐藥性的菌株。

　　盡管免疫功能低下的個體特別容易感染結核病，但并非艾滋病患者才會患病。2019年，全球有140萬人被結核分枝桿菌奪去生命，其中HIV僅20.8萬人。Farhat如今是哈佛大學的醫生和生物信息學家，她說雖然結核病曾被COVID-19短暫取代，但它仍然是全球頭號傳染病殺手。耐藥性結核桿菌是造成這一問題的主要原因。

細菌對抗生素的耐藥性是一項世界性難題。新的解決方案希望能改變局面。來源：Joao Silva/NYT/Redux/eyevine

　　各種類型的抗藥性病原體引發了一場抗生素耐藥性危機，威脅到公共衛生、農業、畜牧業等各領域。但是找出這些菌株并確定有效的治療方法是個棘手的工作。在資源有限的國家，很難建設起具備處理特別傳染性病原體（如結核分枝桿菌）資格的實驗室，而用于檢測藥物敏感性的儀器可能需要數日才能返回結果。在許多情況下，醫生只有在一種或多種標準抗生素失敗后才進行耐藥性檢測。在等待結果期間，患者可能會開始一個不必要或無效的抗生素療程，或未經治療就離開診所。

　　Farhat和其他研究者正求助于諸如原子力顯微鏡、基因組學和機器學習等工具，以建造能在數分鐘內提供結果的即時診斷測試，進而最大限度地減少錯誤或不必要的處方使用。德國格賴夫斯瓦爾德大學醫學中心的臨床微生物學家Evgeny Idelevich說：“加快檢測速度是當下所需的最重要進展。”

　　檢測細菌生長

　　圓盤擴散試驗是評估微生物藥物敏感性的金標準，可追溯到1889年。研究人員在瓊脂盤上培養細菌，然后將含有抗菌藥物的小紙片貼在細胞表面。如果藥物殺死細菌或阻止細菌生長，紙片周圍的區域就會變得透明，表明微生物對藥物敏感。

　　一些公司利用此原理開發了自動化檢測的抗生素敏感性測試儀器，例如美國BD Biosciences公司的BD Phoenix以及法國bioMérieux公司的VITEK 2。這些系統在含有抗生素的液體培養中培養細菌，并檢測代表細菌生長或死亡的光學變化。由于臨床醫生必須將樣本送到臨床微生物實驗室，再加上檢測通常需要4-8個小時，故可能需要一天或更長時間才能獲得結果[1]。

　　但研究人員也在探索通常與物理科學更密切的分析方法，而不是單純依靠微生物實驗室。

　　例如，2018年，Idelevich設計了一種基于MALDI TOF的液體培養測試微型版本。MALDI TOF是一種質譜技術，它使用激光誘導基質電離，然后離子通過長“飛行管”，最后根據它們的質量和電荷來識別分子。Idelevich等將兩種病原體（銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌）微滴培養物直接放于MALDI TOF的固體基質上，并且每一個細菌微滴都用不同的藥物處理。然后，他們通過專門用于細菌鑒定的MALDI Biotyper對樣本進行處理。特征譜峰的強度可以表明培養菌是否對抗生素敏感或耐藥[2]。

　　2013年，意大利國家研究理事會的Giovanni Longo等發現，當他們把致病性大腸桿菌加在懸臂（微型跳水板樣結構）上，使其暴露于抗生素。由于懸臂上附著的活細菌的微小運動，懸臂會上下移動。如果微生物對抗生素敏感，運動就會停止。在原子力顯微鏡下，幾分鐘內就能看到這種運動，這早于直接觀察到微生物復制，也意味著相比于檢測細菌生長的方法，此測試可以更快地識別活細菌[3]。

　　倫敦大學學院納米技術研究員Rachel McKendry和她當時的研究生Isabel Bennett希望將這種方法應用到臨床。但是，在皮氏培養皿中，將細菌附著在長度為200微米的懸臂上，說起來容易做起來難。Bennett說：“懸臂只有一小部分能附著細菌，有時候它們要么聚集成塊，要么附著太少。”

　　Bennett與Longo的團隊合作對這一過程進行微調時，發現了反射光的巨大差異，表明即使微生物沒有被束縛在懸臂上，也可以發現類似的細菌運動。因此，研究團隊改變了策略：當細菌漂浮在懸臂表面時，他們改變了設置來追蹤細菌。他們用一種堅硬的反光材料制作了懸臂，并開發了軟件來分析細菌的運動，這樣一來讀數就與溶液中細菌的數量成正比[4]。McKendry說，與目前的方法相比，這種看似簡單的信號實際上是檢測抗性的好方法。

　　Bennett建議，盡管該系統尚未商業化，但可以對其進行調整并擴大到臨床使用。反射表面可以轉變成嵌入型，便于將其放置在常規使用的微量滴定板中，并用DVD播放器的光學閱讀器代替原子力顯微鏡來捕捉信號。她說：“這可能是一種非常簡單、低成本的設備。”

　　美國波士頓大學的物理學家Kamil Ekinci正在研究另一種反映細菌抗生素耐藥性的替代品：電流。他的團隊將含有肺炎克雷伯桿菌（引起尿路感染的常見原因）的尿液樣本直接放入含有抗生素的微流體裝置單個通道中，并通過通道跟蹤電導率[5]。Ekinci說：“如果細菌生長并堵塞了通道，它們就會產生更大的電阻。我們大體上是將細菌的生長信號轉化為了電信號。”

　　Ekinci補充道，這樣做的優勢是電信號比顯微鏡圖像更容易放大和展示。他說：“原理上我們的技術可以檢測單個細菌的分裂。”不過他補充說，該方法可能不適用于所有細菌，特別是一些生長緩慢的病原體，如結核分枝桿菌。

　　檢測分子標記

　　基于細菌生長的檢測方法簡單、便宜且無特異性，這種單一的檢測方法適用于廣泛的病原體。但是，由于檢測結果取決于生長條件和使用正確濃度的抗生素，Susanne H?ussler說它“任何別的方面都是缺點”。她在哥本哈根Rigshospitalet醫院研究醫學微生物學。

　　H?ussler等正考慮一種替代方法——基因組學，來尋找耐藥性的線索。哈佛大學流行病學家Sophia Koo說，這種“不依賴培養的檢測方法”是該領域的下一個重大轉變。

　　斯坦福大學傳染病研究員Gary Schoolnik說，檢測抗生素耐藥性機制有關的基因是實現快速診斷的理想途徑，因為它不需要長時間的細菌培養。但是，美國梅奧診所的臨床微生物學家Thomas Grys說，關鍵要知道細菌基因組中的哪些序列是耐藥性關鍵，“不然你很可能會遺漏一個新的機制，或者檢測到一個實際上并不會產生抗藥性的基因片段。”

紙片擴散試驗是揭露抗生素有效性的常用方法。來源：Doncaster and Bassetlaw Hospitals/SPL

　　Schoolnik也是Visby醫學的首席醫療官，這家企業在加州創辦，贏得了由美國國立衛生研究院以及美國衛生與公眾服務部下屬生物醫學高級研究和發展管理局發起的“抗微生物藥物耐藥性診斷”挑戰，并于2020年獲得了1900萬美元獎勵。

　　該公司的檢測是使用簡單的手持設備進行一次性的即時檢驗，以檢測淋球菌等性傳播病原體的耐藥性。該測試側重于對環丙沙星（一種治療淋球菌感染的常用口服抗生素）產生耐藥性的基因突變。淋球菌菌株對環丙沙星耐藥或敏感取決于編碼酶gyrase A的基因突變。

　　基于PCR的檢測方法在臨床的應用有限，因為它需要儀器、試劑和培訓過的技術人員。Visby的診斷測試是通過一個簡單的顏色變化來簡化分析，從而繞過這些限制。擴增后的基因片段會進入設備中的一個腔室，該腔室包含針對每個基因突變體的捕獲探針。探針和基因片段的結合會導致顏色變化，這將反映淋球菌對環丙沙星是敏感還是耐藥[6]。

　　其他人則繼續探索全基因組測序，以捕獲導致抗藥性的基因突變譜。但基于這些信息開發低成本、快速的檢測方式仍然是個難題。研究基因組學與機器學習的英國伯明翰大學數據科學家Nicole Wheeler認為，“這不僅與抗性基因的存在有關，還與它的表達有關。我們收集的轉錄組學和蛋白質組學數據越多，我們就越有可能提高預測耐藥性的精確度。”

　　單純基于基因組測序的技術對某些病原體很有效，如腸道沙門氏菌（Salmonella enterica），但多種調控基因的突變會改變其他病原體的基因表達模式（從而導致耐藥性），包括銅綠假單胞菌。H?ussler說：“一般而言，所有轉錄組數據都在基因組中。但是，有時候觀察轉錄組數據比搜尋所有可能改變基因表達的突變更容易。”

　　例如，2014年，日本大阪理化研究所（RIKEN）的生物工程師古澤力研究了實驗室大腸桿菌菌株在不同抗生素下的適應生長，并且他可以使用基因表達的變化來預測抗性，這比基因組DNA序列更準確[7]。古澤說，基因表達和抗藥性之間的相關性明顯高于抗藥性和基因組標記之間的相關性。

　　未來預測細菌耐藥性

　　H?ussler等人的工作優化了基因組和轉錄組標記的聯用，將其作為預測銅綠假單胞菌抗生素耐藥性的最佳標記[8]。

　　但為了改進模型，他們求助于機器學習。機器學習并非簡單地識別產生耐藥性的基因突變，而是利用算法識別DNA和RNA變異的特征，預測菌株對抗生素的耐藥性[8]。H?ussler表示，算法只能幫助識別關鍵特征，這不會成為最終診斷測試的一部分。不過Wheeler說，這種方法還是可以解決僅通過基因組獲得所有“細菌-藥物”組合的問題。

　　這些算法不僅能告訴醫生病原體目前的耐藥性情況，還能揭示菌株在治療過程中可能產生的抗生素耐藥機制。然而，“仍然很難判斷一個算法是否值得信任，”Wheeler說，“它們是個黑箱。即使你有全部的代碼和數據，也不一定知道，比方說，是什么讓模型判斷樣本A會對阿奇霉素產生耐藥性。”

　　開發人員正在努力解決的另一個問題是過度擬合，Wheeler說，算法可能會“記住數據中大量不重要的特征”，而不是學習找到真正的相關性。由于細菌的基因序列可能非常相似，機器學習工具可能會過度簡化問題，得出錯誤的結論。Wheeler將這個問題比作能力不足的圖像搜索：通過許多農畜照片進行訓練的算法，可能會將一張開闊地的照片識別成羊。細菌經常通過不屬于其基因組的DNA小環狀片段相互傳遞抗生素抗性基因。“但由于基因組的其余部分相同，算法可能會判定菌株仍然敏感，”她說，“而我們想要這些算法模型能從中學到的是抗藥性機制。”

　　鑒于結核病研究和測試的種種限制，Farhat采用了一種機器學習方法，使用整個基因組序列進行預測。今年4月，她和同事描述了一種名為GenTB的網絡工具，它可以預測細菌對幾種結核病藥物的耐藥性[9]。該工具的性能隨著輸入序列數據的質量和所選藥物而變化。Farhat說，盡管導致細菌對結核病一線藥物高達80%耐藥性的是一種常見突變，但有幾種罕見的突變能小幅提高微生物對二線藥物的耐藥性。她說：“有時只有當存在數個這類突變時，你才會看到抗藥性。”

　　尚未完成

　　無論采用哪種方法，研究人員都面臨著同樣的根本挑戰：設計一種能在現有設備上有明顯改進的診斷方法。Grys表示，目前的檢測已經可以在24小時內將結果反饋給臨床醫生，且每次檢測只需1-2美元。“問題不在于一項檢測是否有效，而在于它是否比我們現有的更好。重要的是制定規劃以幫助我們實現這些目標。”

　　一些正在開發的測試，能處理的樣品種類、或細菌/抗生素的種類有限。例如，Visby診斷目前僅限于淋球菌感染，而Ekinci微流體設備需要尿樣，而且不能處理多種細菌引起的感染。其他需要先進顯微鏡或光譜測定（如懸臂）的設備則需要加以調整，才能被全球資源匱乏的診所中非專業的人員使用。bioMérieux微生物學研究主任Alex van Belkum說，因為許多檢測都是用少量藥物測試1-2個微生物，所以它們只攻克了“冰山一角”。他說，“這些方法與目前實驗室的抗生素敏感性自動檢測系統之間還有很大的差距。”

　　McKendry說在新冠疫情期間，已經證明快速檢測對發現和阻止病毒傳播尤為關鍵，同樣地，低成本的即時診斷對減少抗生素濫用也極其重要。“抗生素耐藥性是一個非常復雜的問題，新的檢測方法只是解決方案的一環。”