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　　呂猛　

　　事件描述

　　治療型疫苗代表了當代生物技術應用最前沿的發(fā)展方向，面對如此高技術壁壘的新生事物，我們擬從原理、應用等方面進行最深入的分析，揭開治療型乙肝疫苗的神秘面紗。

　　本文是我們系列報告之首，從技術層面介紹治療型乙肝疫苗的設計原理等情況。文中信息均參考最新的研究文獻，深入分析慢性乙肝的病理及兩類治療型疫苗的研究進展，并對相關上市公司的技術及臨床進展進行點評。

　　后續(xù)我們將分析產(chǎn)業(yè)化層面治療型乙肝疫苗面臨的重大機遇和挑戰(zhàn)，并對相關重點公司進行深入完整的挖掘和梳理，請投資者持續(xù)保持關注。

　　事件評論

　　一、慢性乙型肝炎的病理

　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一種噬肝病原體，它的感染會引起急、慢性肝炎，肝硬化，肝實質(zhì)性細胞癌。HBV在人體內(nèi)以2種形式存在：游離在血液中的病毒顆粒，生活在宿主細胞中。HBV感染成人往往會造成急

性感染，這種情況下，病毒會被宿主的免疫系統(tǒng)識別并清除。但是仍有5%的可能性會轉變成慢性感染，如果不及時清除體內(nèi)的病毒，慢性感染會引發(fā)肝硬化和肝實質(zhì)性細胞癌。HBV感染兒童或者是直接的母嬰傳播則往往會引起慢性感染，比例高達95%。

　　主要有2種學說解釋造成這種現(xiàn)象的成因：第一種是嬰幼兒的免疫系統(tǒng)處在一個不成熟的時期，這個時期的感染不會被機體免疫系統(tǒng)識別為外源物質(zhì)，從而無法引起免疫反應將病原清除；第二種則認為HBV病毒本身帶有的蛋白質(zhì)(參與這個效應的病毒蛋白被認為是HBV的表面蛋白HBsAg)，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的能力，使淋巴細胞更強的向體液免疫分化而減弱了細胞免疫的比例和活力，這種情況導致游離在血液中病毒顆粒可以被體液免疫清除，而生活在宿主細胞中的病原則因為宿主細胞的保護而存活，這部分病原的長期感染配合較低能力的細胞免疫應答造成對肝組織的損傷甚至是癌變。因而，能否徹底清除HBV，除了要利用體液免疫清除血液中的病毒顆粒之外，還需要激發(fā)強烈的細胞免疫將感染HBV的宿主細胞殲滅清除。

　　二、免疫清除HBV的機理體液免疫可以簡單的理解為以抗體作為識別中介

　　隨后進行免疫清除的免疫反應，細胞免疫則可以簡單的理解為以激活的免疫細胞行駛識別和清除的免疫反應。清除感染病原的肝細胞，主要是被激活的免疫細胞識別并接合，而后肝細胞在免疫細胞的作用下被穿孔破裂或誘導調(diào)亡等方式殺傷清除。應該說，只有機體的體液免疫和細胞免疫都同時發(fā)揮作用，HBV在體內(nèi)才能得以清除。體液免疫在HBV感染中常常能夠被激活并行駛功能，而細胞免疫則沒有明顯的效應，使得病毒在細胞內(nèi)逃避免疫清除。所以乙型肝炎治療型疫苗的核心就是上調(diào)機體的細胞免疫，在生物學上就是上調(diào)Th1細胞的活化數(shù)量和CTL細胞的功能。

　　三、表位和MHC對免疫效應的影響

　　那么如何能達到這樣的效果呢？首先應該了解細胞免疫被激活的過程。

　　Th1細胞和CTL細胞都是活化的細胞，他們的活化需要一種叫做APC細胞的參與，而不能直接被外源的物質(zhì)激活�？梢院唵蔚睦斫鉃椋�

　　1、APC細胞攝取了外源的物質(zhì)并在細胞內(nèi)對外源物質(zhì)進行處理，被處理后的外源物質(zhì)的片斷被APC細胞呈現(xiàn)到細胞表面。此時，這些片斷配合“抓持并呈現(xiàn)”(生物學上叫做遞呈)它的APC細胞，再加上其他的細胞分子，三者聯(lián)合刺激并激活免疫細胞，這里面就包括了Th1、Th2和CTL細胞。

　　Th2細胞隨后可以刺激并激活體液免疫。遞呈片斷的分子在生物學上叫做主要組織相容性復合物(MHC)，人的MHC分子叫做HLA。MHC分子有兩種分別是Ⅰ型和Ⅱ型。

　　2、APC細胞同時含有Ⅰ型和Ⅱ型兩種MHC，肝實質(zhì)細胞一般也有并只有MHC-Ⅰ型分子。雖然被APC處理的片斷、MHC分子加上其他的細胞分子三者聯(lián)合同時刺激免疫細胞才能使其活化，但是在具體作用過程中，因為小片斷分子的理化性質(zhì)差異和不同類型的MHC分子的組合，導致了不同的免疫細胞的活化。這種具有一定理化性質(zhì)的小片斷分子在生物學上定義為表位(epitope)。÷

　　需要注意的是：與MHC-Ⅰ型分子組合激活Th1細胞的表位通常叫TH表位，代表分子有破傷風類毒素的通用TH表位；與MHC-Ⅰ型分子組合激活CTL細胞的表位通常叫CTL表位，目前沒有通用表位，但是在HBV中普遍認為HBV的核心蛋白HBC的18-27肽是CTL表位；與MHC-Ⅱ型分子組合激活Th2細胞并最終激活B細胞的表位通常叫做B細胞表位，目前也沒有通用表位，但是在HBV中普遍認為HBV的表面蛋白HBSAG的前體蛋白中含有B細胞表位。

　　被激活的Th1細胞和CTL細胞在體內(nèi)殺傷感染病原的功能細胞之時，需要對帶毒細胞先進行識別(即MHC-Ⅰ型分子需要將HBSAG遞呈到肝實質(zhì)細胞表面，才能使得Th1細胞和CTL細胞識別被感染的肝實質(zhì)細胞)，否則如果不識別則會對正常細胞誤傷，引發(fā)新的疾病。這種識別同樣必須有MHC分子和相關表位的參與，而且與激活的情況一樣，Th1和CTL細胞的殺傷識別都需要MHC-Ⅰ型的輔助。肝實質(zhì)細胞一般也有并只有MHC-Ⅰ型分子，所以肝實質(zhì)細胞在被病原感染之后，只要細胞膜表面同時出現(xiàn)MHC-Ⅰ和相關表位，就能夠接合免疫細胞并被免疫細胞施效。否則，如果缺少這些分子，就算免疫細胞被激活，也不能產(chǎn)生免疫效應。

　　四、免疫原性復合物疫苗

　　免疫原性復合物疫苗(immunogenic complex，IC)，成分是酵母表達的HBsAg全長蛋白質(zhì)免疫親和乙型肝炎免疫球蛋白的重鏈Fc片段，在治療時還需要同時配以氫氧化鋁作為佐劑。前面提到，HBsAg可能是引發(fā)HBV免疫耐受的一個原因，經(jīng)實驗證明，HBsAg確實含有相當強烈的B細胞表位，可在體內(nèi)誘導相關免疫細胞向體液免疫方向分化。

　　真核細胞酵母表達的HBsAg蛋白質(zhì)，在理化性質(zhì)上比原核細胞表達的同源蛋白質(zhì)要更加接近其在人體內(nèi)的天然狀況，因而選擇用酵母表達HBsAg可以大量得到更加接近天然狀況下的免疫抗原。乙型肝炎免疫球蛋白的重鏈Fc片斷通過純化相關血液制品得到，是人體免疫系統(tǒng)中的一種自然分子，對人體不會有毒副作用。不過這里選擇Fc片斷是因為在人體APC細胞表面含有Fc片斷的相關受體蛋白，而且當該受體蛋白與Fc相互接合的時候，APC細胞被這種接合所刺激，會產(chǎn)生較強烈的攝取活動，將Fc及與其免疫親和的HBsAg抗原一并攝取到細胞內(nèi)。隨后HBsAg在APC細胞內(nèi)被處理成不同的表位。特定的表位被MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ分子遞呈，最終激活不同的免疫細胞和免疫反應。IC選用HBsAg和Fc的免疫親和復合物的原理就是通過提高APC細胞攝取HBsAg的活力，大量遞呈表位，對免疫細胞形成強烈刺激，從而達到免疫清除HBV的作用。

　　HBsAg上是否含有CTL表位或TH表位尚沒有得到實驗證實，但是IC對轉基因動物模型的實驗結果顯示在一定的免疫佐劑輔助下能引發(fā)明顯的細胞免疫反應。不過因為HBsAg上含有B細胞表位，所以這種方法能夠較好的清除血液中的病毒顆粒。因為HBsAg的高分泌性使得其在肝實質(zhì)細胞內(nèi)停留時間極短，所以肝實質(zhì)細胞的細胞膜表面幾乎檢測不到HBsAg蛋白，也幾乎檢測不到被肝實質(zhì)細胞自身MHC-Ⅰ遞呈的相關HBsAg表位。這種缺陷可能會導致即使體內(nèi)得到強烈激活的免疫細胞，不過因為無法對感染病原的肝實質(zhì)細胞進行識別而導致無法產(chǎn)生相關的免疫殺傷。

　　五、治療型多肽疫苗(表位疫苗)

　　1、設計進展

　　第一次設計的表位疫苗成分是HBV核心抗原(HBcAg)18-27位氨基酸組成的CTL表位鍵合破傷風類毒素TH表位構成多肽，并在兩端各修飾一個棕櫚酸分子而成。棕櫚酸能大幅度提高多肽分子在體內(nèi)的穩(wěn)定性。這種多肽能夠在體內(nèi)明顯激活CTL細胞和Th2細胞，產(chǎn)生強烈的細胞免疫。HBcAg是HBV的一種蛋白質(zhì)，不論其功能如何，關鍵是在感染HBV的肝實質(zhì)細胞表面能夠檢測到HBcAg的存在。有些實驗結果甚至顯示肝實質(zhì)細胞通過MHC-Ⅰ能部分遞呈HBcAg表位。這樣感染病原的肝實質(zhì)細胞就自動為免疫細胞提供了作用的靶點使得細胞免疫反應得以正常的體現(xiàn)和發(fā)揮。

　　但是同時這個第一次設計的表位疫苗又具有一些缺陷。該設計主要強調(diào)針對體內(nèi)的細胞免疫，確實可以對感染病原的肝實質(zhì)細胞進行殺傷。但是因為缺乏B細胞表位，使得血液中游離的病毒顆粒不能被機體清除，所以在實驗初期，盡管檢測到強烈的CTL反應，但是體內(nèi)HBV的遺傳物質(zhì)(DNA)卻仍然可以被檢測到。這樣嚴重影響了表位疫苗的療效。

　　新一代的表位疫苗在前人的基礎上，在多肽分子內(nèi)部加入了新的設計：連接子(Linker)和B細胞表位。原先的設計中表位與表位通過肽鍵連接，這種連接方式可能因為一些分子間作用力而導致表位的分子柔性減弱，不易于釋放表位的活性表面而減弱了免疫效應。新的設計引入的連接子是一些實驗證實的不具有任何免疫原性的三肽，它們能夠強烈增強多肽的分子內(nèi)柔性，充分暴露自己的活性表面。B細胞表位選用的HBV的PreS2蛋白的18-24位氨基酸組成。PreS2蛋白是HBsAg蛋白的一個前體。引入B細胞表位設計能夠在原先設計的基礎上同時加強體內(nèi)的體液免疫反應，達到清除感染的宿主細胞同時清除游離病毒顆粒的治療效果。

　　多肽在體內(nèi)是很不穩(wěn)定的，盡管兩端設計棕櫚酸分子保護，其半衰期與藥效仍然是一個較大的矛盾。隨著新的理論和技術出現(xiàn)，新的設計通過增強藥效的方法來解決這一矛盾，實驗結果顯示良好。新的理論和技術是指：

　　氨基酸密碼學說和分子模擬對接(molecular simulation docking)技術。氨基酸密碼學說可以簡單的理解為，多個氨基酸不同排列形成的短肽其生物學功能不同，一定順序的氨基酸構成的短肽具有特定的功能。氨基酸分子的主體碳架結構相同，差別在于一個生物學上定義為R的基團，常見的20種氨基酸有20種R基團。多個氨基酸不同的排列可以粗略的理解為多種R基團的不同排列，就像鑰匙的齒一樣。表位可以理解為具有特定功能的多肽，其實起決定作用的就是表位中的R基團的排列組合，形成不同的“鑰匙”，開啟不同的免疫反應。R基團的化學成分主要包含C、H、O三種元素，所以在構成上不同R基團比較相似。

　　2、分子模擬對接

　　不同原子間的作用力是不同的，這種原子間的作用力又構成了分子間作用力的基礎，很多時候生物學上把分子間的作用力定義為分子間的親和力。這種親和力是可以通過實驗測定的，不過比較麻煩。隨著科技的進步，分子的結構得到了物理學的解析，分子間的作用力也得到詳細的確定和測定，研究顯示這種作用力符合量子力學的原理。隨著量子力學原理算法的成功編譯，在設定合理參數(shù)的條件下，分子的結構以及基于結構的相互作用力在計算機水平得到了模擬！模擬分子的相互作用定義為對接，相互作用力的表現(xiàn)方式稱作親和力。這就是分子模擬對接的定義和內(nèi)容。

　　提高藥效的機理就是通過提高表位多肽與遞呈分子間的親和力，提高遞呈效率，增強藥效。表位多肽可以被計算機模擬，在對接計算之后可以得到表位與受體分子的親和力。因為這里的受體分子除了免疫細胞表面的受體外，還包括負責遞呈的MHC分子，所以原理上需要同時滿足兩個高的親和力，就需要對表位進行修改或修飾。

　　調(diào)整后的表位再用新一輪的模擬對接測定親和力，直到篩選到最佳分子。這樣得到的修訂表位具有最強的生物學功能，理論上具有最好的藥效潛力，但是最終的藥效還是要通過實驗結果的證明才能最終確定。

　　六、其他治療方案

　　醫(yī)學上除了吃藥治病之外，建立有效的治療方案對疾病的控制也非常重要。有種方案引起了我們的注意。該方案先將病人的APC細胞純化到體外，然后用理化方法刺激APC細胞增殖，而后將相關表位直接加入細胞培養(yǎng)液中，使增殖后表現(xiàn)為空的MHC分子直接在細胞表面載肽，飽和的APC細胞最后又回注病人體內(nèi)直接激活免疫系統(tǒng)。這個方案比較繁瑣，增加了操作的難度。但是這個方案和以上兩種比較，具有明顯的優(yōu)勢。HBV不會感染APC細胞，理論上不會下調(diào)免疫系統(tǒng)活力，所以該方案能得到激活的免疫系統(tǒng)。載入的表位可以是單獨、高親和力表位，這樣的分子雖然穩(wěn)定性不強，但是與MHC的快速細胞外親和使得它的降解得以避免。載肽飽和的APC細胞還可以進行輕微純化，去除大量外源雜質(zhì)，將毒副作用減至最低。

　　七、治療型疫苗的局限性

　　乙肝患者或攜帶者只要不發(fā)生炎癥，在臨床上醫(yī)生不愿主動打破這種免疫耐受的狀態(tài)。慢性乙型肝炎相關的病癥從生物學上研究顯示可能由HBV直接引起。而是因為HBV和免疫系統(tǒng)的博弈造成的一種長期免疫炎癥傷害。所以盡管有高效的藥物和方案，但是應用的前景大小還要仔細評估。

　　這里提到的藥物和方案都會引起體內(nèi)強烈的CTL反應，會對肝組織造成一定程度的傷害，從而影響到病人的一些肝功能。對此，這些藥物和方案就要根據(jù)病人的具體患病程度而適當調(diào)整。

　　人的HLA分子有很多不同的類型，在模擬對接設計中選擇的MHC受體一般都是受眾人群中比例最高的類型。但是難免在臨床應用時碰到少見的類型，因而療效可能會受到不同的影響。這種情況下要么可以通過測定病人HLA類型的方法，重新設計針對性藥物，走個體化治療的路子，要么可以再回到療效與半衰期的矛盾中，通過調(diào)整藥物的穩(wěn)定性支持療效。

　　八、關于重慶啤酒的治療型多肽疫苗

　　重慶啤酒的治療型多肽疫苗的組成是：HBV核心抗原(HBcAg)18-27位氨基酸組成的CTL表位加破傷風類毒素TH表位連接B細胞表位構成的多肽，并修飾兩個棕櫚酸分子而成。

　　該疫苗現(xiàn)在正處于Ⅱ期臨床實驗中，Ⅱ期臨床實驗一般是驗證藥品的有效性，成功率一般在30%-40%。對于治療型疫苗，Ⅱ期臨床實驗有效性的測定，數(shù)據(jù)主要來源有三：第一，對應Ⅰ期臨床，Ⅱ期臨床是將藥品注入病人體內(nèi)，所以需要檢查病人體內(nèi)除病原檢測之外的其他生化指標。目的是鑒定藥品對病人的毒副作用。第二，需要檢查病人體內(nèi)的病原生化指標。包括蛋白質(zhì)水平、核酸水平、抗體水平等的檢測，這將作為藥效的主要指標。

　　第三，需要檢查隨訪半年后病人的以上兩方面數(shù)據(jù)，以排除疾病復發(fā)的危險。有了這三方面的數(shù)據(jù)并將之處理，才能得到有力的證據(jù)證實Ⅱ期臨床實驗的效果。

　　重慶啤酒的治療型多肽疫苗已經(jīng)順利通過Ⅰ期臨床實驗，充分說明該疫苗對正常人群沒有毒副作用。配合HBV致病性的研究背景，我們判斷病毒不會對人體免疫系統(tǒng)造成明顯破壞、對正常組織沒有致細胞病變效應(CPE)，所以該疫苗在病人體內(nèi)應不會引起不良的毒副反應。至于Ⅱ期臨床實驗的最終結果要得到隨訪后的檢測數(shù)據(jù)才能最終判定。所以我們判斷，就目前而言，在原理上，該疫苗設計合理，具有潛在的成功可能性，但毫無疑問，臨床實驗仍可能面對失敗的風險。

　　治療型疫苗可以簡單的看成刺激免疫系統(tǒng)行駛免疫清除的免疫原性抗原。而在慢性乙型肝炎這個模型中，治療型疫苗的核心功效是激活免疫系統(tǒng)的細胞免疫反應，即Th1細胞的活化數(shù)量和CTL細胞的反應。從理論上講，較強烈的激活細胞免疫反應可以達到對感染病原的肝實質(zhì)細胞的殺傷和清除，但是如果反應過于強烈同樣也會引起一定程度的肝組織損傷，造成ALT(肝細胞特有的轉氨酶，是肝損傷的重要指標)水平的增高，這可能會增加治療型疫苗在應用層面的風險。從疫苗的設計背景分析，人HLA分子具有多種類型，這可能會在一定程度上影響到疫苗的藥效，從而也增加其在應用層面的風險。

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